文獻題目：A single TCP transcription factor modulates leaf size in Citrus

發(fā)表期刊：Horticultural Plant Journal

影響因子：6.2

物種：柑橘

發(fā)表時間：2026.1.21

發(fā)表單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

藍景科信提供：DAP-seq技術(shù)服務(wù)

主要研究內(nèi)容

葉片是植物核心光合器官，其形態(tài)與大小直接決定光合效率和環(huán)境適應(yīng)性，是關(guān)鍵農(nóng)藝性狀。TCP家族轉(zhuǎn)錄因子參與植物器官生長發(fā)育調(diào)控，其中CIN類TCP可抑制細胞增殖、促進葉片分化成熟，但柑橘葉片大小的分子調(diào)控機制仍不明確；GRF家族作為葉片生長的正向調(diào)控因子，其與TCP在柑橘中的協(xié)同調(diào)控機制尚未被解析。

研究表明，CsTCP2主要在柑橘葉原基中部表達，CRISPR-Cas9敲除該基因后，植株葉片顯著增大，葉面積提升44.1%，該表型由細胞大小與細胞數(shù)量同步增加所致。該研究通過DAP-seq分析鑒定出CsTCP2的43439個顯著結(jié)合峰，其中18.7%分布于基因啟動子區(qū)，且在轉(zhuǎn)錄起始位點上游500bp附近高度富集，其核心結(jié)合基序為GGGNCCAC。結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，CsTCP2直接結(jié)合并調(diào)控701個下游差異表達基因，分別為563個下調(diào)基因和138個上調(diào)基因，這些基因富集于細胞分化、激素信號、細胞壁重塑及維管發(fā)育等通路，其中CsGRF5被確定為關(guān)鍵下游靶基因。后續(xù)實驗進一步證實，CsTCP2可直接結(jié)合并抑制CsGRF5啟動子，最終明確CsTCP2-CsGRF5模塊是控制柑橘葉片分化成熟與大小的關(guān)鍵通路。

本研究闡明了柑橘中TCP轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控葉片大小的分子機制，不僅豐富了木本植物葉片發(fā)育的理論體系，也為柑橘株型改良、光合效率提升和優(yōu)質(zhì)育種提供了關(guān)鍵基因靶點與重要理論支撐。

圖1. CsTCP2在葉原基的中部區(qū)域表達。（A）通過RT-qPCR檢測CsTCP2在不同組織中的相對表達水平。（B）通過RT-qPCR檢測CsTCP2在連續(xù)發(fā)育階段（P6~P10）葉原基中的相對表達水平。（C~K）RNA原位雜交結(jié)果顯示，在卡里佐枳橙幼嫩莖尖橫切面上，CsTCP2在葉原基（C~H）和刺原基（I~K）中表達。

圖2. 卡里佐枳橙cstcp2突變體的葉片增大表型。（A–F）種植8個月的完整植株表型，包括野生型（WT）（A）及5個獨立的cstcp2 突變株系（B–F）。（G–K）5月齡野生型（G）與cstcp2突變體（H–K）的典型葉片。（L–O）8月齡野生型（L）與cstcp2突變體（M–O）的典型葉片。（P）CRISPR-Cas9介導(dǎo)的卡里佐枳橙CsTCP2純合/雙等位基因突變（cr-cstcp2）。

圖3. cstcp2突變體表型分析。(A–D) 5月齡野生型（WT）與cstcp2突變體頂生小葉的定量統(tǒng)計：葉片寬度 (A)、葉片長度 (B)、長寬比 (C)、葉面積 (D)。(E–H) 10 月齡植株葉片表皮細胞形態(tài)觀察。(E) 野生型與cstcp2#3突變體鋪板細胞的掃描電鏡（SEM）代表性圖像。(F–H) 葉片近軸面鋪列細胞面積 (F)、遠軸面鋪列細胞面積 (G) 及氣孔密度 (H) 的定量統(tǒng)計。(I–N) 10 月齡植株葉片解剖結(jié)構(gòu)觀察。(I) 野生型與cstcp2#5突變體成熟功能葉的半薄橫切切片。(J–N) 海綿組織細胞面積 (J)、海綿組織細胞密度 (K)、維管束面積 (L)、木質(zhì)部寬度 (M)、木質(zhì)部面積 (N) 的定量統(tǒng)計。

圖4. 柑橘中CsTCP2靶基因的全基因組鑒定。（A）YFP（對照）與YFP-CsTCP2在煙草表皮細胞中的亞細胞定位。（B）經(jīng)DAP-seq鑒定的CsTCP2結(jié)合峰在基因組上的分布。（C）CsTCP2結(jié)合峰在轉(zhuǎn)錄起始位點上游500bp附近顯著富集。（D）從CsTCP2結(jié)合峰序列中鑒定到的富集的DNA結(jié)合基序（GGGNCCAC），P值由MEME軟件計算得出。（E）韋恩圖展示CsTCP2結(jié)合基因（DAP-seq結(jié)果）與cstcp2突變體對比野生型的差異表達基因（RNA-seq結(jié)果）之間的重疊關(guān)系。（F-G）CsTCP2直接結(jié)合基因的GO富集分析（F）及KEGG通路富集分析（G）。

圖5. CsTCP2調(diào)控葉片發(fā)育相關(guān)基因。（A）熱圖展示野生型與cstcp2突變體中，經(jīng)DAP-seq與RNA-seq分析鑒定到的共同靶基因表達水平。（B-G）qRT-PCR驗證篩選得到的CsTCP2靶基因：CsTCP2（B）、CsYAB1（C）、CsIAA14（D）、CsWOX4（E）、CsGRF5（F）、CsXTH6（G）。（H）利用純化的GST-CsTCP2融合蛋白與羧基熒光素標(biāo)記的CsGRF5啟動子片段探針開展EMSA實驗。（I）雙熒光素酶實驗所用報告載體與效應(yīng)載體結(jié)構(gòu)示意圖。（J）不同效應(yīng)因子在卡里佐枳橙葉片原生質(zhì)體中對CsGRF5啟動子的相對活性。