分子互作是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，不同生物分子之間的識(shí)別、結(jié)合與調(diào)控，貫穿于基因表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞命運(yùn)決定等幾乎所有生命過程。生物分子間的相互作用（蛋白-DNA、蛋白-RNA、蛋白-蛋白）是生命科學(xué)研究的核心內(nèi)容，也是揭示基因調(diào)控、蛋白功能及疾病機(jī)制的關(guān)鍵。Pull-down實(shí)驗(yàn)（又稱拉下實(shí)驗(yàn)）既能用于篩選未知互作分子，也可用于驗(yàn)證已知分子間相互作用。根據(jù)研究對(duì)象的不同，主要分為蛋白Pull-down、DNA Pull-down和RNA Pull-down三大類。

一、蛋白Pull-down

1.1 技術(shù)簡介

蛋白Pull-down是研究蛋白-蛋白相互作用的經(jīng)典體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)。常用標(biāo)簽：GST、His、Halo等，其中Halo標(biāo)簽因共價(jià)結(jié)合、穩(wěn)定性高、非特異性背景低的優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于真核蛋白互作研究。

1.2 技術(shù)原理

蛋白Pull-down的原理是將已知的“誘餌蛋白"與親和標(biāo)簽融合表達(dá)，利用該標(biāo)簽與固相基質(zhì)（如瓊脂糖樹脂或磁珠）上配體的特異性結(jié)合，將誘餌蛋白固定在基質(zhì)上；再與含有潛在“獵物蛋白"的樣品（如細(xì)胞裂解液）孵育，使誘餌蛋白捕獲互作蛋白；經(jīng)洗滌去除未結(jié)合的雜蛋白，洗脫獲得互作復(fù)合物，最終通過Western blot、質(zhì)譜等方法鑒定獵物蛋白。

圖1 蛋白Pull-down流程圖

1.3 技術(shù)優(yōu)勢(shì)

l 無需針對(duì)靶蛋白的特異性抗體，直接驗(yàn)證體外蛋白互作；

l Halo Tag標(biāo)簽與磁珠共價(jià)結(jié)合，顯著降低非特異性結(jié)合背景。

1.4 常用標(biāo)簽及表達(dá)系統(tǒng)

二、DNA Pull-down

2.1 技術(shù)簡介

DNA Pull-down是研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)，主要用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究。該技術(shù)以特定DNA序列為探針，從細(xì)胞核蛋白中篩選并鑒定能夠與DNA結(jié)合的蛋白，如轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白等。

2.2 技術(shù)原理

DNA Pull-Down使用標(biāo)記的DNA探針作為誘餌，與提取的內(nèi)源細(xì)胞核蛋白進(jìn)行孵育，捕獲與DNA探針特異性結(jié)合的蛋白（比如轉(zhuǎn)錄因子），最終使用蛋白質(zhì)譜的方法，鑒定出特異性結(jié)合的蛋白。

圖2 DNA Pull-down流程圖

2.3 技術(shù)優(yōu)勢(shì)

l 可富集低豐度DNA結(jié)合蛋白。

l DNA探針制備簡便，無需構(gòu)建復(fù)雜文庫，直接體外驗(yàn)證結(jié)合。

三、RNA Pull-down

3.1 技術(shù)簡介

RNA在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，非編碼RNA（lncRNA、circRNA、miRNA）是當(dāng)前研究熱點(diǎn)。RNA與蛋白的相互作用是非編碼RNA發(fā)揮功能的核心機(jī)制。RNA Pull-down是檢測(cè)RNA-蛋白互作的核心體外技術(shù)，主要用于篩選與驗(yàn)證RNA結(jié)合蛋白（RBPs）。

3.2 技術(shù)原理

RNA Pull-Down根據(jù)目標(biāo) RNA 序列設(shè)計(jì)特異性 DNA 模板，通過體外轉(zhuǎn)錄制備標(biāo)記 RNA 探針；先將標(biāo)記探針與鏈霉親和素磁珠偶聯(lián)，制備固定有 RNA 探針的磁珠復(fù)合物，再與細(xì)胞蛋白提取液共孵育，捕獲能與 RNA 探針特異性結(jié)合的蛋白并形成 RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。經(jīng)洗滌去除非特異性結(jié)合蛋白、完成富集后，對(duì)富集蛋白進(jìn)行LC?MS/MS 質(zhì)譜分析，即可鑒定出與目標(biāo) RNA 特異性互作的蛋白質(zhì)。

圖3 RNA Pull-down流程圖

3.3 技術(shù)優(yōu)勢(shì)

l 靈敏度高，可富集低豐度RNA結(jié)合蛋白。

l 可直接篩選與目標(biāo)RNA結(jié)合的蛋白。

四、三種Pull-down實(shí)驗(yàn)應(yīng)用場(chǎng)景

五、常見問題解答

Q1：我的研究部位可以跟實(shí)驗(yàn)所用部位不一致嗎？

建議使用與研究目標(biāo)一致的組織樣本，以保證結(jié)果可靠性。

Q2:我需要提供哪些材料？

DNA Pull-down與RNA Pull-down需要提供探針序列/模板及組織等材料。

蛋白Pull-down需要提供蛋白CDS序列/質(zhì)粒模板及組織等材料。

Q3：結(jié)果交付結(jié)果包含哪些信息？

質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)原圖，質(zhì)譜差異分析及富集分析等全套數(shù)據(jù)。

Q4：強(qiáng)結(jié)合蛋白更容易鑒定到嗎？

不一定，結(jié)果受蛋白豐度、洗滌條件、質(zhì)譜靈敏度影響。建議篩選后針對(duì)性驗(yàn)證。

Q5：蛋白Pull-down和Co-IP的區(qū)別？

蛋白Pull-down不依賴靶蛋白特異性抗體，體外驗(yàn)證蛋白直接相互作用；Co-IP依賴靶蛋白特異性抗體，在細(xì)胞生理內(nèi)源環(huán)境下驗(yàn)證蛋白直接或間接相互作用。

蛋白、DNA、RNA三大Pull-down快速選擇：

? 看蛋白互作→蛋白Pull-down

? 看轉(zhuǎn)錄調(diào)控→DNA Pull-down

? 做非編碼RNA/RNA結(jié)合蛋白→RNA Pull-down