文獻(xiàn)題目：The PtobZIP55–PtoMYB170 module regulates the wood anatomical and chemical properties of Populus tomentosa in acclimation to low nitrogen availability

發(fā)表期刊：Journal of Integrative Plant Biology

影響因子：9.3

發(fā)表時(shí)間：2024.11.14

發(fā)表單位：中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所

藍(lán)景科信提供：DAP-seq技術(shù)服務(wù)

主要研究內(nèi)容

木材（次生木質(zhì)部）是建筑、造紙和生物能源的重要原料，其形成是受多種轉(zhuǎn)錄因子和環(huán)境因素協(xié)同調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過程。毛白楊是我國重要的速生用材樹種，但其人工林多建于氮素貧瘠土壤，低氮脅迫嚴(yán)重制約其生長和木材形成?，F(xiàn)有研究已證實(shí)bZIP和MYB類轉(zhuǎn)錄因子參與木材發(fā)育調(diào)控，但其在低氮條件下調(diào)控木質(zhì)部形成的分子機(jī)制尚不明確。

PtobZIP55作為S1-bZIP亞家族核定位轉(zhuǎn)錄因子，在毛白楊次生木質(zhì)部中特異性高表達(dá)且受低氮顯著誘導(dǎo)。功能驗(yàn)證表明，過表達(dá)PtobZIP55可緩解低氮造成的生長抑制與葉片黃化，優(yōu)化木材解剖結(jié)構(gòu)并促進(jìn)木質(zhì)素沉積；敲除則表現(xiàn)相反的表型，且該調(diào)控僅作用于木質(zhì)素、不影響纖維素含量。進(jìn)一步分子實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PtobZIP55可直接結(jié)合PtoMYB170啟動(dòng)子的G-box元件并激活其轉(zhuǎn)錄，二者表達(dá)模式與功能高度協(xié)同。

研究借助DAP-seq技術(shù)共鑒定出431個(gè)PtoMYB170 潛在靶基因，明確其的核心結(jié)合基序?yàn)榈湫?/span>AC元件，并從中篩選出木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因PtoDAHPS1、PtoEMB1144、PtoPAL1、PtoCSE1。后續(xù)通過酵母單雜交、ChIP-qPCR及雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PtoMYB170 可直接結(jié)合并轉(zhuǎn)錄激活上述4個(gè)木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因，且這些靶基因均受低氮誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)，PtoMYB170還能調(diào)控PAL的表達(dá)與酶活，通過PAL介導(dǎo)的氮素循環(huán)途徑提升氮素利用，完整構(gòu)建“PtobZIP55-PtoMYB170-木質(zhì)素合成基因"的低氮適應(yīng)調(diào)控通路。

本研究系統(tǒng)解析了楊樹響應(yīng)低氮脅迫的木材形成調(diào)控機(jī)制，為培育耐貧瘠、木材品質(zhì)優(yōu)良的楊樹新品種提供了理論依據(jù)與關(guān)鍵基因靶點(diǎn)。

圖1. PtobZIP55基因的表達(dá)模式。（A）PtobZIP55基因在毛白楊不同組織中的表達(dá)模式。（B）正常氮（NN）和低氮（LN）條件下，PtobZIP55基因在次生木質(zhì)部中的相對(duì)表達(dá)量。圖A和圖B中的柱形圖數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（n=3），各子圖中柱形圖上不同字母表示處理間存在顯著差異。（C~I）在PtobZIP55啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因植株中，檢測到GUS基因在幼苗（C）及多種維管組織中的表達(dá)，包括葉脈（D、E）、葉柄（F、G）和莖（H、I）。Xy代表木質(zhì)部，Ph代表韌皮部。比例尺：C為1 cm，D~I為100 μm。

圖2. 正常氮（NN）和低氮（LN）條件下培養(yǎng)2個(gè)月的4月齡毛白楊PtobZIP55敲除株系、過表達(dá)株系及野生型（WT）植株的形態(tài)特征與木材性狀。（A）NN和LN條件下PtobZIP55轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株的生長表現(xiàn)，比例尺為10 cm。（B、C）PtobZIP55轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株的株高（B）和莖粗（C）。（D）經(jīng)鹽酸染色的PtobZIP55轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株莖第八節(jié)間橫切片，Xy代表木質(zhì)部，比例尺為100 μm。（E~I）PtobZIP55轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株莖的木質(zhì)部寬度（E）、木質(zhì)部/莖橫截面積比（F）、導(dǎo)管頻率（G）、導(dǎo)管管腔面積（H）及雙纖維細(xì)胞壁厚度（I）。（J）PtobZIP55轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株次生木質(zhì)部中的木質(zhì)素含量。圖（B、C）及（E~J）中柱形圖數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（n=3），各子圖中柱形圖上不同字母表示組間存在顯著差異（P<0.05）。

圖3. PtobZIP55調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄組分析及PtobZIP55直接結(jié)合PtoMYB170啟動(dòng)子序列并激活其表達(dá)（A）韋恩圖展示正常氮（NN）條件下PtobZIP55過表達(dá)株系與野生型（WT）楊樹的差異顯著表達(dá)基因（SDEGs）數(shù)量，以及低氮（LN）與正常氮處理的野生型楊樹間的差異顯著表達(dá)基因數(shù)量。（B）對(duì)PtobZIP55 過表達(dá)株系與正常氮野生型、低氮與正常氮處理野生型這兩組對(duì)比中共同的差異顯著表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路分析。（C）與正常氮供應(yīng)的野生型楊樹相比，兩組對(duì)比中共同參與木質(zhì)素生物合成且呈同步上調(diào)或下調(diào)的差異顯著表達(dá)基因的表達(dá)水平。（D）酵母單雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，酵母細(xì)胞中PtobZIP55可與PtoMYB170的啟動(dòng)子序列相結(jié)合。（E）EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)，體外條件下PtobZIP55可結(jié)合PtoMYB170啟動(dòng)子區(qū)域的兩個(gè)位點(diǎn)（P1和P2）。（F）ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)表明，體內(nèi)條件下PtobZIP55可結(jié)合PtoMYB170啟動(dòng)子區(qū)域的兩個(gè)位點(diǎn)（P1和P2）；以PtobZIP55-綠色熒光蛋白（GFP）融合蛋白表達(dá)植株的染色質(zhì)為材料，用抗GFP抗體進(jìn)行免疫沉淀，以免疫球蛋白G（IgG）作為陰性對(duì)照，毛白楊泛素基因（PtoUBQ）作為內(nèi)參基因。（G）本氏煙草葉片中PtobZIP55激活PtoMYB170啟動(dòng)子的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。實(shí)驗(yàn)組為35S::PtobZIP55+PtoMYB170_Pro::LUC，陰性對(duì)照組為62-SK+0800-LUC、35S::PtobZIP55+0800-LUC和62-SK+PtoMYB170_Pro::LUC。侵染后第3天記錄熒光圖像。（H）檢測LUC和REN酶活性，計(jì)算二者活性比值作為最終的轉(zhuǎn)錄活性。以62-SK+PtoMYB170_Pro::LUC作為對(duì)照，其LUC/REN比值設(shè)定為1。圖（F）、（H）中柱形圖數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（n=3），各子圖中柱形圖上不同字母表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間存在顯著差異。

圖4. 正常氮（NN）和低氮（LN）條件下培養(yǎng)2個(gè)月的4月齡毛白楊PtoMYB170 敲除株系、過表達(dá)株系及野生型（WT）植株的形態(tài)特征與木材性狀。（A）PtoMYB170轉(zhuǎn)基因及野生型楊樹的生長表現(xiàn)。比例尺為10 cm。（B、C）PtoMYB170轉(zhuǎn)基因及野生型楊樹的株高（B）和莖粗（C）。（D）經(jīng)鹽酸染色的PtoMYB170轉(zhuǎn)基因及野生型楊樹莖第八節(jié)間橫切片。Xy為木質(zhì)部。比例尺為100μm。（E~I）PtoMYB170轉(zhuǎn)基因及野生型楊樹莖的木質(zhì)部寬度（E）、木質(zhì)部/莖橫截面積比（F）、導(dǎo)管頻率（G）、導(dǎo)管管腔面積（H）及雙纖維細(xì)胞壁厚度（I）。（J）PtoMYB170轉(zhuǎn)基因及野生型楊樹次生木質(zhì)部中的木質(zhì)素含量。圖（B、C）及（E~J）中柱形圖數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（n=3），各子圖中柱形圖上不同字母表示組間存在顯著差異（P<0.05）。

圖5. PtoMYB170直接結(jié)合PtoDAHPS1、PtoEMB1144、PtoPAL1 和 PtoCSE1 的啟動(dòng)子序列。（A）通過DAP-seq鑒定得到的PtoMYB170靶基因的潛在結(jié)合元件。（B~E）酵母單雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，酵母細(xì)胞中PtoMYB170可分別結(jié)合PtoDAHPS1（B）、PtoEMB1144（C）、PtoPAL1（D）和PtoCSE1（E）的啟動(dòng)子序列。（F）PtoMYB170在PtoDAHPS1、PtoEMB1144、PtoCSE1和PtoPAL1啟動(dòng)子序列上的結(jié)合位點(diǎn)示意圖。（G~J）ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，體內(nèi)條件下PtoMYB170可結(jié)合上述靶基因的啟動(dòng)子序列；以PtoMYB170-綠色熒光蛋白（GFP）融合蛋白表達(dá)植株的染色質(zhì)為材料，采用抗GFP抗體進(jìn)行免疫沉淀，以免疫球蛋白G（IgG）作為陰性對(duì)照，毛白楊泛素基因（PtoUBQ）作為內(nèi)參基因。（K~N）本氏煙草葉片中PtoMYB170激活各靶基因啟動(dòng)子的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)；以35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的PtoMYB170表達(dá)載體與各靶基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶（LUC）報(bào)告載體共轉(zhuǎn)化組為實(shí)驗(yàn)組，以62-SK空載體與0800-LUC空載體共轉(zhuǎn)化組、35S::PtoMYB17與0800-LUC共轉(zhuǎn)化組、62-SK與各靶基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的LUC報(bào)告載體共轉(zhuǎn)化組為陰性對(duì)照，侵染后第3天記錄熒光圖像。（O）檢測LUC和REN的酶活性，計(jì)算二者活性比值作為最終的轉(zhuǎn)錄活性。以62-SK空載體與各靶基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的LUC報(bào)告載體共轉(zhuǎn)化組為對(duì)照，并將各對(duì)照組的LUC/REN比值均設(shè)為1。圖（G~J）、（O）中柱形圖數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（n=3），各子圖中柱形圖上不同字母表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間存在顯著差異。

圖6. 正常氮（NN）和低氮（LN）條件下，毛白楊PtoMYB170敲除株系、過表達(dá)株系及野生型（WT）植株次生木質(zhì)部中PtoPAL1基因的表達(dá)水平及其酶活性。（A、B）分別為PtoMYB170轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株中PtoPAL1基因的表達(dá)水平（A）和PAL的酶活性（B）。各子圖中柱形圖數(shù)值均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（n=3），柱形上方不同字母表示組間存在顯著差異（P<0.05）。

圖7. 毛白楊適應(yīng)低氮（LN）條件下，PtobZIP55激活PtoMYB170轉(zhuǎn)錄并進(jìn)一步正向調(diào)控木質(zhì)素生物合成基因、促進(jìn)次生木質(zhì)部木質(zhì)素沉積的調(diào)控模式示意圖。低氮誘導(dǎo)PtobZIP55的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，PtobZIP55結(jié)合到PtoMYB170的啟動(dòng)子序列并激活其表達(dá)；PtoMYB170進(jìn)一步結(jié)合到木質(zhì)素生物合成通路關(guān)鍵基因PtoDAHPS1、PtoEMB1144、PtoPAL1和PtoCSE1的啟動(dòng)子序列，提高這些基因的轉(zhuǎn)錄水平，最終導(dǎo)致毛白楊次生木質(zhì)部中木質(zhì)素含量增加?；虮磉_(dá)水平與木質(zhì)素濃度隨低氮環(huán)境變化呈增強(qiáng)趨勢，該過程通過箭頭及深色背景加粗文本框進(jìn)行標(biāo)注。